واکنش زنجیره ای پلیمراز
فاکتور هایی که روی کار آیی PCR تاثیر دارند:
1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال میشود
2- غلظت زیادرشته های هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .
روش PCR توسط مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان DNA polymerase استفاده میشد. این آنزیم در اثرحرارت دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase گفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنشPCR بصورت اتوماتیک انجام میگیرد.
پارامتر های موثر در PCR :
1- زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد
2- دمای Annealing پرایمرها که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد
3- زمانPrimer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد
4- - تعداد سیکلها
5- Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد
6- غلظت dNTP ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )
7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.
8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR
10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط
11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد ( Tm یکسان داشته باشند).
پرایمر ها ی PCR بصورت کاملا" اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظر DNA هدف طراحی میگردند. پرایمر ها 30-20 بازدارند و پرایمر های بیش از 30 باز اختصاصیت خوبی ندارند. همچنین پرایمر باید دمای آنیلینگ بالا داشته باشد. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته با شند چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا" سیستم کار نمیکند. انتهای 3` دو پرایمر نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل میشود.
نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است تو سط نرم افزارهایی مانند Blast آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیکر میتوانندAnneal گردند.
در هر سیکل PCR تعداد مولکولهای DNA دو برابر میشود. رشته های DNA توسط حرارت (95-93درجه ) از یکدیگر باز میشوند ( Denaturing ) و سپس دردوره بعدکه حرارت پایین می آید (60-50درجه ) پرایمر ها بصورت اختصاصی به ناحیه هدف متصل میشوند ( Annealing ). آنزیم Taq DNA polymerase در دمای مطلوب (72درجه ) ودر بافر مخصوص , چهار( dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) dNTP را طبق رشته الگو بهم متصل میکند (Extension ) .
لازم به ذکر است که DNA های کوتاه ( Short target product ) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential ) و DNA های بلند ( long target product ) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود میباشند بصورت تصاعد حسابی (linearly ) زیاد میشوند .
مواقعی که پرایمر ها کاملا" مکمل DNA هدف( الگو) نباشند :
1- پرایمر هایی که برای ایجاد موتاسیون در یک ژن طراحی میگردند
2- پرایمرهایی که سمت 5` آنها جایگاه شناسایی آنزیم محدودگر تعبیه میشود تا بتوان محصول PCR را توسط آن آنزیم برش داد . این کار برای کلون کردن محصول PCR انجام میشود.
3- پرایمر هایی که لازم است محصول PCR آنها دارای پروموتور باشد و برای بیان یک ژن کاربرد دارند
فاصله دو پرایمر باید کمتر از 10 kb باشد ( کارآیی همانند سازی برای محصول PCR بیش از 3kb کمتر است ) . بهتر است پرایمر ها را بر حسب کاری که لازم داریم طراحی شوند
چگونگی رد یابی ( detect ) محصول PCR :
1- هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار ( پروب )
3- الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی اکریلامید
انواع PCR ( بمنظور تصحیح محصول ):
1- Hot start PCR : عبارت است از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR ( ترجیحا" انزیم پلیمراز) بطوریکه بلا فاصله بعد ار دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه میشوند ( استفاده از , PCR gem و آنتی بادی آنزیم پلیمراز )
- Hot start بکمک آنتی بادی : مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه میکننددرنتیجه فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار میکند. هنگامیکه دمای واکنش به 94 درجه میرسد آتی بادی دناتوره میشود و دو باره پلیمراز فعال میشود.
- Hot start بکمک Ampliwax : به دیواره لوله های محصوص اینکاربه نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی ئاکنش را میپوشاند . آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار میدهند . در دمای 94 درجه این واکس بخار میشود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا میکند
2- Touch down PCR : در این روش دمای آنیلینگ ازدمای بالاتر از Tm بندرت کاهش میابد وموجب کاهش محصول کاذب و پرایمر دایمر میشود.
3- Nested PCR : مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد برای جلوگیری از بالابردن مقدار DNA و مهار واکنش توسط پرایمر های خارجی قطعه طویلتری همانند سازی میشود و از محصول PCR اول که بیشتر DNA هدف همانند سازی شده است یک واکنش دیگر با پرایمر های داخلی انجام میگیرد. در این روش اختصاصیت و حساسیت PCR بالا میرود.
5- Long distance PCR : با این روش قطعات ببیش از 20 kb همانند سازی میشوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمر ها به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز klon taq استفاده میشود.این آنزیم نسخه ای از DNA poly است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط میشود و فاقد 5` اگزو نوکلئازی است
کلونینگ با PCR :
1- قرار دادن جایگاه شناسایی آنزیمهای برش دهنده در طرف 5` سکانس پرایمر.
مشکلات : این جایگاه ممکن است روی قطعه همانند سازی شده نیز وجود داشته باشد.
گاهی این جایگاه هنگام هضم شدن با آنزیم اشکال ایجاد میکندکه باید تعدادی باز به انتهای 5` پراپمر اضافه شود.
استفاده از جایگاه دو آنریم متفاوت در هضم اشکال ایجاد میکند.
2- Blunt end ligation : برای اینکار دو انتهای قطعه همانند سازی شده باید Polish شود این کار توسط آنزیمهای کلنو و T4 DNA polymerase ( پرکردن قسمت over hang ) و یا آنزیم های S1 nuclease و Mong bean nuclease انجام میشود
3- - T vector پلاسمید ناقل را با آنزیم EcoRV ویا هر آنزیم دیگرکه DNA را بصورت Blunt برش میدهد هضم میکنند سپس توسط آنزیم Terminal transferase یا آنزیم Taq poly تعدادی T به انتهاهای 3` رشته های پلاسمید خطی شده اضافه میکنند .( لازم به ذکراست که آنزیم Taq poly دارای خاصیت ترمینال ترانسفرازی است و تعدادی A به انتهای 3` محصول آمپلی فای شده اضافه میکند ) . با انجام واکنش Ligation پلاسمید و محصول PCR را بهم متصل میکنند.
4- تولید نیمه جایگاه شناسایی یک آنزیم برش دهنده در طرف 5` پرایمر. قطعات با T4 poly nucleotidkinase و ATP فسفریله میشوند و سپس بهم متصل میگردند ، بعد توسط یک آنزیم هضم شده و کلونینگ انجام میگیرد .
شکل شماره 13- کلون کردن محصول PCR به روش T-A cloning : پلاسمید با یک آنزیمی که DNA را بصورت blunt قطع میکند هضم میشود سپس توسط آنزیم ترمینال ترانسفراز یا Taq پلیمراز و dTTP یک باز T به انتهاهای 3`- OH آن اضافه میگردد. واکنش Ligation از این وکتور با محصول PCR که در انتهاهای 3`-OH آن باز A قرار دارد انجام میگیرد و پلاسمید در یک باکتری ترانسفرم میشود.
ایجاد تغییر در محصول PCR :
میتوان درسمت پایه5`` پرایمر یک پروموتور ویا جایگاه اتصال ریبوروم ( Ribosom Binding Site ) تعبیه نمود، همچنین میتوان یک Non tanslated leader بین پروموتور و ژن قرار داد تا ناحیه برای شروع سنتز پروتئین مناسب باشد. این کاربرد بنام Expression PCR گفته میشود
باید ها و نباید ها در PCR
1. هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کار تهیه کنید
2. اعمال قبل و بعد از PCR جدا از همدیگر انجام گیرند
3. برای استفاده ازهر ماده از پیپت جدا گانه و اختصاصی استفاده کنید
4. از پیپت هایی که دارای plug هستند و یا از پیپت های یکبار مصرف استفاده کنید
5. مواد ذخیره آزمایشگاه را تقسیم کرده و فریز کنید و هرچند وقت صحت آنها راکنترل کنید
6. هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تا موادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند رسوب کنند
7. چند ین کنترل منفی حین آزمایش Run کنید
8. برای انحام آزمایشهای تاییدی ازموادفریز شده استفاده کنید
9. هیشه DNA آمپلی فای شده را خارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید
10. هنگام کار با PCR product مقداری از آن را جدا گانه نگهدارید